Search
Close this search box.

Zjawisko elektroporacji i jego aplikacja w technice wykonywania szczepień typu DNA

Elektroporacja to obecnie szeroko stosowana metoda zmiany struktury błony komórkowej (membrany) stosowana w biotechnologii i medycynie do dostarczania leków i genów do żywych komórek. Jest to również alternatywna metoda sterylizacji wody i konserwacji żywności. Zjawisko elektroporacji można opisać jako gwałtowny wzrost  przepuszczalności membrany spowodowanej zewnętrznie przyłożonymi krótkimi i intensywnymi impulsami elektrycznymi. Opracowano różne modele teoretyczne w celu opisania elektroporacji, wśród których najszerzej akceptowany jest model przejściowych porów wodnych.

Zgodnie z tym modelem w podwójnej warstwie lipidowej komórki tworzą się pory hydrofilowe membrany, gdy ta wystawiona jest na zewnętrzne impulsy elektryczne. W błonie komórkowej pory hydrofobowe powstają w wyniku samorzutnych wahań temperatury błony komórkowej. W komórce wystawionej na zewnętrzne pole elektryczne obecność indukowanego potencjału transbłonowego zapewnia wolną energię niezbędną do strukturalnych przegrupowań fosfolipidów błonowych, a tym samym umożliwia hydrofilowe tworzenie porów. Pory hydrofilowe tworzą się tylko w niewielkiej części membrany wystawionej na działanie pole elektryczne. Mimo prób wizualizacji zmian zachodzących w błonie (wykonano struktury wywołane przyłożeniem impulsu elektrycznego), reorganizacja strukturalna i tworzenie hydrofilowych porów nie były do tej pory bezpośrednio obserwowane. Wszystkie dane dostępne zostały uzyskane jako pośredni dowód przepuszczalności błony. Dane dostępne są przez pomiary zmian przewodnictwa wywołanych przyłożeniem impulsu elektrycznego i obserwacje transportu molekularnego przez błonę komórkową. Elektroporacja błony komórkowej zachodzi, ponieważ błona komórkowa wzmacnia się poprzez zastosowane zewnętrznie pole elektryczne – jego przewodnictwo jest o kilka rzędów wielkości niższe niż przewodnictwo ośrodka zewnątrzkomórkowego i cytoplazmy komórkowej. Ten teoretyczny opis potencjału transbłonowego indukowanego na komórce sferycznej wystawiony na działanie pola elektrycznego jest znany jako równanie Schwana. Indukowany potencjał transbłonowy dla komórki kulistej można obliczyć jako:

UTI =−1.5rEcosφ

gdzie r jest promieniem ogniwa, E jest natężeniem przyłożonego pola elektrycznego, a φ kątem między kierunkiem pola elektrycznego a wybranym punktem na komórce. Indukowany potencjał transbłonowy, a tym samym maksymalna elektroporacja, występują na biegunach ogniwa wystawionych na działanie pola elektrycznego skierowanego w stronę elektrod (rys. 1).

Rys. 1 Schemat elektroporacji

Zjawisko elektroporacji może być wykorzystywane również w procesie dawkowania materiału szczepiennego DNA. Dla pełnego obrazu zjawiska należy zrozumieć istotę szczepień mRNA i szczepionek genetycznych. Proces wytwarzania szczepionki rozpoczyna się od zsekwencjonowania genomu wirusa w kwasie nukleinowym (ustalenie kolejności elementarnych monomerów w biopolimerach – kwasy nukleinowe i białka). Najpierw ocenia się rozpoznawanie białka przez układ odpornościowy człowieka, a następnie naukowcy wytwarzają DNA lub mRNA kodujące produkcję tego białka i formułują je w szczepionkę. Wytworzony w ten sposób materiał genetyczny jest wstrzykiwany do organizmu i aktywuje układ odpornościowy. Organizm wytwarza przeciwciała, które walczą z podawanym białkiem. Tak wyszkolony organizm jest przygotowany do walki z wirusem w przyszłości. Jednak komórki ludzkie nie akceptują łatwo obcego DNA lub mRNA. Po podaniu szczepionki materiał genetyczny jest w większości neutralizowany w organizmie, przez co nie wywołuje w odpowiednim stopniu pożądanej odpowiedzi immunologicznej.

Szczepionki wykorzystujące kwas nukleinowy mRNA są zamknięte w kropelkach tłuszczu (nanocząsteczkach lipidowych), które łącząc się z błoną komórkową pomagają kwasowi przeniknąć do komórki. Cząstka mRNA może funkcjonować poza jądrem w częściach komórki, w przeciwieństwie do cząsteczki DNA, która musi być dostarczona do wnętrza jądra. Cząsteczka DNA jest większa i aby mogła zostać wykorzystana w szczepionce, musi najpierw przeniknąć przez zewnętrzne warstwy komórki, a następnie przez błonę jądrową komórki do jądra.

Aby zwiększyć prawdopodobieństwo dostania się odpowiedniej cząstki do wnętrza komórki, opracowano kilka metod wspomagających wprowadzanie nośnika informacji genetycznej do organizmu. Do takich metod należy sonoporacja, czyli wykorzystanie fal dźwiękowych do przenikania przez zewnętrzną warstwę komórki. Kolejnym rozwiązaniem technicznym wspierającym wnikanie odpowiednich cząstek do organizmu są iniekcje pod wysokim ciśnieniem. W tym przypadku tłok strzykawki pod wpływem nagłego wyzwolenia energii wtłacza w ciało pod wysokim ciśnieniem wąski strumień cieczy. Zastosowano mikrofale uderzeniowe, w których lek wprowadza się do organizmu bez użycia igły. Testy przeprowadzono przy użyciu pistoletów genowych, które wstrzykują do organizmu cząsteczki złota pokryte DNA. Zjawisko elektroporacji znalazło również zastosowanie w procesie opracowywania nowych technologii podawania szczepionek. Jest to metoda laboratoryjna stosowana od kilkudziesięciu lat do przenoszenia materiału genetycznego do komórek, a także mająca zastosowanie do chirurgicznej dezaktywacji ludzkich guzów nowotworowych.

Samo zjawisko elektroporacji  to nowoczesna i uniwersalna metoda umożliwiająca przenikanie makrocząsteczek z przestrzeni międzykomórkowej do wnętrza komórek dzięki kanałom tworzącym się, pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego. Oprócz naturalnych kanałów i pomp budujących błonę komórkową, powstałe  pory stanowią dodatkową drogę transportu nanocząsteczek (rys.2).

 Rys. 2 Schemat transportu nanocząsteczek w komórce stymulowanej polem elektrycznym

Niedawno naukowcy z Inovio Pharmaceuticals, Inc. opracowali urządzenie do szczepienia zwiększające jego skuteczność poprzez zastosowanie elektroporacji. Jak w każdym typowym szczepieniu, procedura rozpoczyna się od nakłucia w ramię. Urządzenie jest następnie dociskane do skóry tuż nad strzałem. Aktywowane są cztery impulsy elektryczne o czasie trwania 42 ms, prostokątnym kształcie i amplitudzie prądu 200 mA. Podany impuls elektryczny powoduje krótkotrwałe i odwracalne otwarcie kanałów w komórkach, co sprzyja przenikaniu materiału DNA do wnętrza komórek. Kanały zamykają się na końcu impulsu elektrycznego. Wprowadzony kod DNA wyzwala odpowiedź immunologiczną organizmu. Zastosowana technika zwiększa ponad dziesięciokrotnie odpowiedź immunologiczną organizmu w porównaniu z tradycyjnym zastrzykiem.

Produkt firmy Inovio, Inc., Celletra 3PSPTM,  przeznaczony do dostarczania szczepionek z elektroporacją, jest kompaktowy i zasilany bateryjnie. W jednym cyklu pracy na w pełni naładowanej baterii można zaszczepić około 100 osób. Baterie należy wymienić po 50 cyklach ładowania (rys.3).

Rys. 3 Zestaw do szczepień firmy Inovio 

Nawet jeśli technologia i szczepionki Inovio nie zostaną przyjęte w świecie cywilnym, to podczas tej pandemii, mogą okazać się przydatne. „Inwestycje, które teraz podejmujemy, są związane z reakcją na COVID, ale pod wieloma względami przygotowujemy się również do następnego wydarzenia”, mówi Chris Earnhart, dyrektor ds. technologii w programie biotechnologii wspomagających w firmie JPEO-CBRND. „To może być wydarzenie związane z bronią biologiczną lub  kolejny endemiczny wybuch.”

A może nadszedł czas na aktualizację techniczną. Broderick z Inovio zauważa, że „ludzie po raz pierwszy zaczęli podawać leki za pomocą strzykawki około 1650 roku, kiedy do igieł używano gęsich piór. „To wydaje się być przestarzałym paradygmatem ” – mówi. „W czasach, gdy w naszych kieszeniach nosimy więcej mocy obliczeniowej niż ta, która trafiła na Księżyc, powinniśmy być otwarci na nowsze technologie dostarczania szczepionek”. Na przykład, rezygnując ze strzykawek

W opracowaniu wykorzystano:

  1. Emily Waltz, Vaccines go electric, IEEE Spectrum, 6/2021
  2. EugeneVorobiev, •Nikolai Lebovka (edytorzy), Electrotechnologies for Extraction from Food Plants and Biomaterials, Springer Verlag, 2008…